内部監視 - 低PIMグループ株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 12529 (2023) この記事を引用

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カンピロバクタージェジュニとカンピロバクターコリは重要な食中毒の人獣共通感染症病原体であり、抗菌薬耐性の増加傾向により懸念を引き起こしています。長期にわたる監視研究が、農場内の多様性と耐性カンピロバクターの伝播動態を経時的に調査するために、5 つの乳牛農場で異なる年齢グループの動物を対象に実施されました。循環分離株 (170 C. jejuni および 37 C. coli) の耐性表現型をブロス微量希釈によって決定し、選択した 56 株の分離株を Oxford-Nanopore ロングフラグメント配列決定技術を使用して全ゲノム配列決定し、完全に分離され環状化されたゲノムを得ました。 (染色体とプラスミドの両方)。 C. ジェジュニはすべての農場から分離されましたが、C. コリは 2 つの農場のみから分離されましたが、耐性率は C. ジェジュニよりも C. コリの方が高く、成体動物よりも子牛の方が高かったです。一部の遺伝子型（例：農場 F1 の ST-48、gyrA_T86I/tet(O)/blaOXA-61、F4 の ST-12000、aadE-Cc/tet(O)/blaOXA-489）は研究全体を通じて持続しましたが、他の遺伝子型は散発的にのみ存在しました。検出されました。他の分離株からの細胞外遺伝子の獲得と細胞内突然変異イベントが、群れ内に広がる耐性遺伝子型の出現につながるプロセスとして特定されました。オックスフォードナノポアテクノロジーズシーケンスによるモニタリングは、耐性カンピロバクターの農場内蔓延の根底にある複雑な分子疫学を解読するのに役立ちました。

カンピロバクター症は先進国におけるヒトの細菌性胃腸炎の主な原因であり、カンピロバクター・ジェジュニ種とカンピロバクター・コリが主な原因となっています。家禽に次いで、牛は、汚染された食品および/または水の摂取、または動物やその糞便との直接接触による、ヒトへのカンピロバクター感染の主な感染源と考えられています1。カンピロバクター感染は通常自然に治癒するため、抗菌療法は全身性の重度の感染症にのみ適応されます。それにもかかわらず、抗菌薬耐性のカンピロバクターは感染症治療の選択肢を危険にさらすため、懸念事項となっています。下痢の経験的治療法として処方されることが多いフルオロキノロン (FQ) とテトラサイクリン 2 は、耐性が高いため効果が低下しています。したがって、マクロライド系抗菌薬は、重篤なカンピロバクテリウム症が検査室で確認された症例に対して選択される抗菌薬となっています3,4。

バスク地方（スペイン北部）で実施された横断的疫学研究に基づくこれまでの調査結果では、乳牛が耐性カンピロバクターの重要な保有源であり5,6、FQなどの医学的に極めて重要な抗菌薬に対する耐性の蔓延が示された。マクロライドに対する耐性は依然として低いままですが、増加しています6,7。特定の抗菌剤耐性形質の獲得は細菌の適応度の増加（例、gyrA 遺伝子の C257T 点変異）と関連しています 8,9 が、他の形質の獲得は適応度の低下につながります（例、23S rRNA 遺伝子の点変異 2075G）10、11。これは、現在観察されているカンピロバクター属の高い FQ 耐性率と低いマクロライド耐性率をある程度説明できるかもしれません。家畜から12．

いくつかの研究では、年齢に関連したカンピロバクターの糞便排出パターンの変動と、異なる遺伝子型の農場内での持続性の違いが報告されています 13、14、15。しかし、耐性遺伝子型の群れ内伝染動態は完全には解明されておらず、抗生物質耐性の広がりに関しては依然としてギャップが存在しています。カンピロバクターにおける最小発育阻止濃度 (MIC) を使用した表現型と全ゲノム配列決定 (WGS) を使用した遺伝子型との間の高い相関関係 16 と、細菌の詳細なゲノム特性評価に対する WGS の能力 17 を考慮して、ここでは縦断的研究が実施されました。特定の耐性遺伝子型が長期的な集団定着にさらに適応できるかどうかを調査するために、5つの乳牛農場で16か月間実験が行われました。表現型抗菌薬感受性試験と WGS を組み合わせて、長期間にわたって収集されたさまざまな年齢グループの動物 (子牛、未経産牛、授乳牛) から回収された分離株の特徴を調べました。環状細菌ゲノムとプラスミドの完全なアセンブリを保証し、抗菌薬耐性遺伝子 (ARG) の位置に関する正確な情報を取得するために、オックスフォードナノポアテクノロジー (ONT) に基づくロングリードシーケンスが使用されました。複雑な疫学と、乳牛農場内での C. ジェジュニおよび C. コリの抗生物質耐性の獲得と拡大の動態を理解することは、農場での管理慣行に関する推奨事項のベースラインを設定するのに役立ちます。

8). Reads were adapter-trimmed with Porechop v.0.2.4 with the default parameters37 (Wick 2017) and filtered by length and quality using Filtlong v.0.2.0 (https://github.com/rrwick/Filtlong) by discarding short reads (< 1000 bp) and keeping the best 90% of the remaining reads for further analyses (–min_length 1000 –keep_percent 90). Then, the resulting fastq reads were de novo assembled using Unicycler38. MLST profiles were determined from unassembled long-reads using Krocus39. New combinations of existing alleles along with representative isolate data were submitted to the Campylobacter MLST database pubMLST for new ST definition40. Genomes were processed to predict plasmid- and chromosome-derived contigs using PlasFlow (v.1.1) (Krawczyk et al.41), and small circular contigs were queried against blastn database (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) using default parameters and the lowest E-value was considered the best hit. BLASTn v.2.12.0+42 and ABRicate v.1.0.1 (T. Seemann, https://github.com/tseemann/abricate) were used to screen the draft genomes against ResFinder43 for the detection of acquired antimicrobial resistance genes and against VFDB_setB (full dataset) for virulence factors. Chromosomal point mutations associated with AMR were investigated by screening unassembled reads against the PointFinder database44 using Resfinder v.4.1.045. Databases used were all updated on 11/05/2022. Resfinder hits were filtered at 90% coverage and identity. Virulence genes were filtered at 90% coverage and 60% identity, and the pattern of presence/absence of these genes was used as a typing scheme for comparative genomic fingerprinting, supported with a dendrogram. The hierarchical clustering analysis for the dendrogram was performed with the unweighted pair-group method with arithmetic mean (UPGMA) based on the Jaccard distance matrix, using the function hclust (v.3.6.1) of the R statistical package v.3.6.3. Plasmid alignments were performed using MAUVE in progressive mode46 in Geneious Prime v. 2020.2.4 (https://www.geneious.com) software and GDR arrangements were graphically represented using SnapGene v.5.2.4 (http://www.snapgene.com/). Parsnp v1.7.447 along with the implemented RaxML v.8.2.1248 was used to perform core genome analyses and construct phylogenetic trees based on the chromosomal genomes to identify structural and point variations (SNPs), with defaults parameters and specifying -r ! parameter to randomly select the reference from the set of genomes analysed. The resulting trees were visualised with iTOL49./p>