標準化されたマルチ - 低PIMグループ株式会社

Nature Microbiology volume 7、pages 2128–2150 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

配列決定の進歩にもかかわらず、標準化の欠如により研究間の比較が困難になり、地球規模の複数の生息地にわたる微生物群集の構造と機能についての洞察が妨げられています。ここでは、地球マイクロバイオームプロジェクトのために収集された 880 個の微生物群落サンプルの多様なセットのマルチオミクス分析を紹介します。アンプリコン (16S、18S、ITS) およびショットガンメタゲノム配列データ、および非ターゲットメタボロミクスデータ (液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析法およびガスクロマトグラフィー質量分析法) が含まれます。私たちは、標準化されたプロトコルと分析手法を使用して、環境全体にわたる微生物関連代謝産物と微生物分類群の関係と共起に焦点を当てて微生物群集を特徴づけ、これにより並外れた規模で多様性を調査することが可能になりました。メタゲノムおよびメタボロームデータの参照データベースに加えて、追加の研究を組み込むためのフレームワークを提供し、進化するコミュニティリソースの形で既存の知識を拡張できるようにします。私たちは、あらゆる微生物と代謝物が環境によって選択される以外はどこにでも存在するという仮説を検証することによって、このデータベースの有用性を実証します。我々の結果は、代謝物の多様性が微生物群集と環境の両方に関連する代謝回転と入れ子性を示すのに対し、微生物に関連する代謝物の相対的な存在量は変動し、生息地固有の方法で特定の微生物共同体と共生することを示しています。さらに、地球の環境（陸生の植物の表面と土壌、淡水と海洋動物の糞便など）を識別する際の特定の化学、特にテルペノイドの力や、Conexibacter woesei（陸生土壌）、Haloquadratum などの特定の微生物の力も示します。 walsbyi (海洋堆積物) と Pantoea dispersa (陸生植物の残骸)。このリソースは、地球上の多様な生息地からの微生物群集内の分類群と代謝産物についての洞察を提供し、微生物と化学の生態学の両方に情報を提供し、宿主と環境のマルチオミクスマイクロバイオーム研究の基盤と方法を提供します。

微生物生態学の主な目標は、微生物群集の構造、これが微生物の分類学的、系統学的および機能的構成とどのように関連しているか、そしてそれらの関係が時空を超えてどのように変化するかを理解することです。単一の研究では、そのような推論を可能にするためにすべての環境を繰り返しサンプリングすることはできないため、異なる研究にわたるメタ分析を可能にする標準化された手法の使用を促進することが最も重要です1、2、3、4。初期の取り組みでは、細菌/古細菌群集の 16S リボソーム RNA (rRNA) 配列決定のための標準化プロトコルに焦点を当て、環境内で群集がどのように構造化されているかについての洞察を提供し、宿主会合と塩分濃度の勾配に沿った微生物の分離の強力な軸を裏付けました 1,5。ショットガンメタゲノミクスデータに焦点を当てた最近の取り組み 6、7、8、9 は、環境全体にわたる機能的可能性に関するさらなる洞察を提供し始めており 10、11、12、13、14、現在の最先端の方法ではマルチオミクスアプローチが採用されています。メタゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクスおよび/またはメタボロミクスを含む15、16、17、18、19、20、21、22、23、24。

微生物は、コミュニケーションから防御まで重要な機能を実行する多様な二次代謝物を生成し 25,26,27 、人間の健康と環境の持続可能性に利益をもたらすことができます 28,29,30,31,32,33,34。メタゲノムマイニングとトランスクリプトミクスは微生物群集の機能を特徴付ける強力な方法 10,14,24 ですが、機能的多様性を理解するためのより強力なアプローチは、代謝物の存在を確認し 19,20,21 、地球全体の分布を正確に記述する化学的証拠を生成することです。ここでは、代謝産物の存在と相対的な存在量を直接評価し、地球環境全体の微生物群集における代謝産物プロファイルの正確な説明を提供するアプローチを紹介します。これまでにいくつかの研究がタンデムメタゲノミクスとメタボロミクスを採用してきた22,23,35,36,37,38,39,40が、多くは比較的限定された技術的手法を採用したり、比較的少数のクラスの代謝産物をプロファイリングしたり23,35,40しており、研究間の比較ができていませんでした。それは私たちの理解を広げるかもしれません。さらに、以前のいくつかの研究は、範囲が単一の環境または生息地に限定されています20、23、24、35、36、37、38、39。私たちの研究は、複数の生態系を含めることにより、メタゲノミクスとメタボロミクスを使用した微生物群集のマルチオミックス分析に関してこれまでに報告されたものを大幅に超えています。私たちが適用するアプローチは、非標的メタボロミクスを使用した二次代謝産物の直接調査によってメタゲノミクスを補完します。

1.5–2 kb DNA fragments’ (Oxford Nanopore Technologies). The resulting product consists of uniquely tagged rRNA operon amplicons. The uniquely tagged rRNA operons were amplified in a second PCR, where the reaction (100 µl) contained 2 U Platinum SuperFi DNA Polymerase High Fidelity (Thermo Fisher) and a final concentration of 1X SuperFi buffer, 0.2 mM of each dNTP, and 500 nM of each forward and reverse synthetic primer targeting the tailed primers from above. The PCR cycling parameters consisted of an initial denaturation (3 min at 95 °C) and then 25–35 cycles of denaturation (15 s at 95 °C), annealing (30 s at 60 °C) and extension (6 min at 72 °C), followed by final extension (5 min at 72 °C). The PCR product was purified using the custom bead purification protocol above. Batches of 25 amplicon libraries were barcoded and sent for PacBio Sequel II library preparation and sequencing (Sequel II SMRT Cell 8M and 30 h collection time) at the DNA Sequencing Center at Brigham Young University. Circular consensus sequencing (CCS) reads were generated using CCS v.3.4.1 (https://github.com/PacificBiosciences/ccs) using default settings. UMI consensus sequences were generated using the longread_umi pipeline (https://github.com/SorenKarst/longread_umi) with the following command: longread_umi pacbio_pipeline -d ccs_reads.fq -o out_dir -m 3500 -M 6000 -s 60 -e 60 -f CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -F AGRGTTYGATYMTGGCTCAG -r AATGATACGGCGACCACCGAGATC -R CGACATCGAGGTGCCAAAC -U ‘0.75;1.5;2;0’ -c 2./p>{sample_identifier}_{sequence_identifier}’), concatenated into a single fasta file and imported. We then used QIIME 2’s ‘vsearch’ plugin132 to dereplicate sequences and then cluster them at 65% similarity (that is, due to rapid evolution at bacterial ITS regions). The 65% OTU feature-table had 365 samples and 285 features. The concatenated fasta file and 65% OTU feature-table were uploaded to Qiita as distinct preparations (study: 13114). We then used QIIME 2’s90 ‘feature-table’ plugin to exclude singleton OTUs and samples with a total frequency of <500 reads, and the ‘deicode’91 plugin to estimate beta-diversity for each dataset using robust Aitchison distances91. The final feature-table for full-length rRNA operon beta-diversity analysis included 242 samples and 196 features./p>90)./p>